葡萄糖二酸及其衍生物可参与人体的代谢活动, 从而调节人体内的激素环境, 降低细胞癌变可能性, 发挥防癌抑癌的作用, 对多种癌变病症均有成效。除此之外, 葡萄糖二酸还能够降低胆固醇, 对糖尿病的治疗也有一定作用, 在胆结石的预防和控制过程中起着重要作用^[8]。葡萄糖二酸及其衍生物具有极好的抗氧化和解毒性能, 能够通过抑制胰岛β 细胞的凋亡减轻四氧嘧啶诱导的糖尿病, 缓解盐酸伊立替康对肠道黏膜的损伤^{[9, 10]}。葡萄糖二酸还可应用于医学影像相关领域^{[11, 12, 13]}, 为更准确判断出病变位置提供了强有力的理论依据。

在聚酰胺类、羟基化的尼龙及聚二甲基硅氧烷等的聚合过程中充当单体^[14]; 用于合成缓释肥料、生物可降解聚合物和各种薄膜等^[15]; 在无毒、可生物降解的磷酸盐替代物的生产中充当原料^[16]; 用于家用混凝土外加剂、防腐剂和洗涤剂的制作等; 还可在电镀中作为金属防腐的螯合剂。

高效液相色谱法操作比较简单且测量结果精确, 研究者多采用此方法检测葡萄糖二酸, 流动相一般为酸性溶液, 目的是为了抑制有机酸解离, 检测通常使用紫外吸收检测器, 检测波长为210 nm, 使用极性反相色谱柱能较好地保留葡萄糖二酸, 得到对称的峰形。

离子色谱法具有快速、准确和灵敏的特点, 可以进行多组分分析, 除了电导检测器之外, 还发展出电化学检测器和紫外光度检测器等。可用以分析无机阴离子、有机阳离子和阴离子、金属阳离子、糖类、氨基酸类等。葡萄糖二酸也可采用离子色谱法检测, 但由于费用较高, 使用率低于高效液相色谱法。

可用于检测葡萄糖二酸的方法还有咔唑比色法、葡萄糖酸脱氢酶反应法、气相色谱-质谱法以及高效毛细管电泳测定法^[17]。其中, 前两种方法对葡萄糖二酸的定量分析不太准确, 后两种方法则由于步骤复杂和设备局限性而未被广泛应用。

化学氧化法通过氧化葡萄糖制备葡萄糖二酸, 是目前制备葡萄糖二酸相对通用的方法。葡萄糖氧化时生成多种物质^[18], 如图2所示, 除产物葡萄糖二酸, 还有葡萄糖酸和葡萄糖醛酸等的存在。为提高葡萄糖二酸产率, 需要控制反应条件和氧化反应的作用位点。目前葡萄糖二酸的化学氧化法主要以硝酸氧化法、TEMPO氧化法和金属催化剂催化氧化法为主。

图2

Figure 2

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	图2 葡萄糖氧化制备葡萄糖二酸的机理Figure 2 Mechanism of glucose oxidation to prepare gluconic acid

3.1.1 硝酸氧化法

利用硝酸作为氧化剂将葡萄糖氧化为葡萄糖二酸及其他小分子量有机酸, 通过控制反应进行的程度得到相应产物。Kiely D E等^[19]通过加氧加压方式提高硝酸利用率, 降低反应的剧烈程度, 减少副产物的产生, 最终产品得率达85%。Fischer K等^[20]改变原料, 使用各种类型生物质, 仅用30 min进行反应, 大大减少了反应时间, 节省了原料使用量。Nabyl Merbouh等^[21]使用与硝酸类似的硝酸盐氧化葡萄糖, 在反应中密切检测反应温度和酸碱度, 减少了反应中的降解, 并探讨不同的分离方法。

硝酸氧化法的最大优势是反应中硝酸既是溶剂又是试剂, 实验易于操作, 不足之处在于, 副产物多, 增加产物分离难度。20世纪50~60年代, 工厂采用硝酸氧化法生产葡萄糖二酸, 结果发现设备腐蚀严重, 投入高收益低, 而且反应剧烈, 产生很多有害气体, 如NO和NO₂等, 严重污染环境, 因此, 在大规模工业化生产中未能予以运用。

3.1.2 TEMPO电化学氧化法

TEMPO即2, 2, 6, 6-四甲基-1-哌啶氧自由

基, 是一种亚硝酰自由基, 内部的自由基可以在氮氧间形成共振结构。利用TEMPO作为催化剂介导, 采用电化学法氧化葡萄糖制备葡萄糖二酸应用广泛, 反应条件比较温和, 没有金属参与, 对产物有一定的选择性, 限制一些不可回收副产物的产生。

Ibert M等^[22]在(0~5) ℃和pH=11~11.5条件下, 分别以4-AcNH-TEMPO和TEMPO为催化剂, Br₂、NaClO和Cl₂等作为氧化剂, 在反应过程中适当调节各反应物之间的比例, 反应结束后, 调节pH=3.8, 室温静置, 沉淀, 能够制得葡萄糖二酸单钾盐, 收率可达63%。

Koga T等^[23]在含一定浓度TEMPO的1 mol· L^-1的NaOH溶液中, 以玻璃碳作为电极, 在不同条件(pH、温度、共氧化剂)下氧化D-葡萄糖, 并对反应结果进行分析, 目标产物收率可以达到50%。

该方法在绿色环保方面具有一定的参考价值, 反应过程中要注意控制反应温度和pH值以使反应效率达到最佳。另外, 该法所使用的催化剂相对来说比较昂贵, 需要进行相应的改进。

3.1.3 金属催化剂氧化法

金属催化剂分为单金属催化剂和双金属催化剂, 常用单金属催化剂有Pt、Pb、Au和Cu等, 双金属催化剂则主要是以上单金属两两结合, 所用的载体主要包括C、SiO₂、TiO₂和Al₂O₃等。

Xin Jin等^[24]采用Pt催化剂催化氧化葡萄糖, 结果表明, Pt₁Cu₃/TiO₂催化剂上葡萄糖转化率和葡萄糖二酸选择性最高。在反应温度45 ℃时, 向26 mL、0.56 kmol· m^-3的葡萄糖溶液中以0.2 mL· min^-1速率滴加1.56 kmol· m^-3的NaOH溶液2 h, 通入100 kPa的O₂反应24 h, 葡萄糖转化率最大(100 %)时葡萄糖二酸收率25.4%, 相关机理如图3所示。

图3

Figure 3

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	图3 Pt1Cu3/TiO2催化剂催化葡萄糖到葡萄糖二酸的反应机理[24]Figure 3 Reaction mechanism of glucose to glucaric acid catalyzed by Pt1Cu3/TiO2 catalyst[24]

虽然葡萄糖二酸产率略低, 但 Pt₁Cu₃/TiO₂性能稳定, 重复使用3次后, 催化活性无明显下降, 是一种较为环保的催化剂。使用PtPd/TiO₂催化剂做进一步研究^[25], 发现其具有更高的催化性能和更少的副产物。该方面的研究还有很大的发展空间, 需要找到更环保、更廉价及催化性能更好的催化剂。

Pamuk V等^[26]以V₂O₅作为催化剂, 空气作为氧化剂, 空气和底物(糖浆)逆流接触, 添加无机酸(如HNO₃、H₂SO₄等)作为辅料提高产率。当底物浓度0.3 g· g^-1, 柱温60 ℃, 催化床层高14.3 cm(71.5 g), 空气流速0.1 L· s^-1时, 最终产率为63.9%。这种方法反应条件较为温和, 能得到较高产率, 但仍有不足之处, 如实验中使用的催化剂有剧毒, 反应时间越长, 产物收率下降越明显。

近年来微生物法制备葡萄糖二酸的研究受到研究者的青睐。与化学法相比, 该方法损耗的原料较少, 但仍有产量低、下游分离纯化困难和产物不稳定等缺陷, 未来发展还有更大空间。现阶段的微生物法主要是通过发酵工程、基因工程或二者结合得到目标产物。

刘叶等^[27]在毕赤酵母中异源表达pseudomonas putida KT2440来源的udh基因及小鼠来源的miox基因, 发现初始质量浓度为60 g· L^-1的葡萄糖为碳源, 初始pH为5.5, 接种龄为24 h和接种体积分数为25 %时, 重组毕赤酵母生成的葡萄糖二酸产量达到(967.60± 3.90) mg· L^-1。在此基础上, 研究者将重组毕赤酵母在3 L发酵罐中进行补料分批培养, 在补加葡萄糖及肌醇的情况下, 葡萄糖二酸产量达到(2.60± 0.04) g· L^-1, 葡萄糖二酸产量有了很大的提升。这种方法是生物法制备葡萄糖二酸的新途径, 为今后的研究提供了新思路, 具有十分广阔的发展前景和进步空间。

陈娜等^[28]用酿酒酵母作为底盘微生物, 选取来源于拟南芥的肌醇加氧酶基因miox 4和来源于丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶基因udh进行实验, 将miox 4和udh在酿酒酵母的基因组delta位点上进行整合, 葡萄糖二酸产量可达3.80 g· L^-1, 在酿酒酵母细胞中构建了葡萄糖二酸的生物合成途径。这种方法不仅在细胞中成功构建葡萄糖二酸的生物法合成路径, 且葡萄糖二酸产量创下新高, 在未来能够广泛应用在酿酒酵母细胞的代谢工程研究中。

其他的一些微生物法合成葡萄糖二酸的主要成就如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 生物法制备葡萄糖二酸的主要成果 Table 1 Main achievements in the preparation ofgluconic acid by biological method 文献 主要工作 成果 [29] 首次用合成生物学的方法在E.coli中构建葡萄糖二酸的合成途径 实现了由葡萄糖到葡萄糖二酸的生物制备 [30] 构建多肽支架, 依据蛋白间的相互作用, 将3种酶组成蛋白复合体 产量提高了5倍, 达到2.5 g· L-1 [31] miox的N端融合 葡萄糖二酸的产量提高至4.85 g· L-1 [32] 使用不同来源的ino1、miox和udh在大肠杆菌中合成葡萄糖二酸 葡萄糖二酸产量可达73 g· L-1

表1 生物法制备葡萄糖二酸的主要成果 Table 1 Main achievements in the preparation ofgluconic acid by biological method