引用本文
葛维娟, 孟歌, 谢紫轩, 陈萍, 白宏. NaH催化合成3,4-二氢-2 H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮及其抗肝癌细胞活性评价 [J]. 工业催化, 2020,28(2): 58-63.
Ge Weijuan, Meng Ge, Xie Zixuan, Chen Ping, Bai Hong. Synthesis of 3,4-dihydro-2 H-pyrazino[2,1-b]quinazoline-1,6-dione catalyzed by NaH and its anti-hepatoma activities [J]. Industrial Catalysis, 2020,28(2): 58-63.  
DOI:10.3969/j.issn.1008-1143.2020.02.011
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NaH催化合成3,4-二氢-2 H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮及其抗肝癌细胞活性评价
葛维娟1, 孟歌2,3,*, 谢紫轩2, 陈萍2, 白宏1
1.西安培华学院医学院,陕西 西安 710125
2.西安交通大学药学院,陕西 西安 710061
3.复旦大学化学系手性分子合成工程中心,上海 200433
通讯联系人:孟 歌,博士,教授,硕士研究生导师。 E-mail: mgfudan@fudan.edu.cn

作者简介:葛维娟,1988年生,女,陕西省咸阳市永寿县人,硕士,讲师,研究方向为药物化学。

收稿日期: 2019-09-30
基金资助: 陕西省教育厅专项研究课题(18JK1086); 国家自然科学基金(21871055)
摘要

以邻氨基苯甲酰胺(5)为原料,依次经分子间环合、烷基化、氨解和分子内环合四步反应成功合成目标化合物3,4-二氢-2 H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮(10),总收率为46.5%,其中,中间体(8)、(9)及目标化合物(10)均未见文献报道,其结构经1H NMR和MS(ESI)确证,并采用MTT法初步评价目标化合物的体外抗肝癌活性。结果表明,3,4-二氢-2 H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮对SMMC-7721具有明显的抑制活性,优于阳性对照药舒尼替尼,可为进一步发现新型抗肝癌药物提供先导结构,也为该类衍生物的大量合成和结构改造提供参考方法。

关键词: 精细化学工程; 3,4-二氢-2 H-吡嗪并[2,1-b]喹唑啉-1,6-二酮; 稠合氮杂环; 三环; 合成; 抗肿瘤
中图分类号:O643.36+2;TQ426.94    文献标志码:A    文章编号:1008-1143(2020)02-0058-06
Synthesis of 3,4-dihydro-2 H-pyrazino[2,1-b]quinazoline-1,6-dione catalyzed by NaH and its anti-hepatoma activities
Ge Weijuan1, Meng Ge2,3,*, Xie Zixuan2, Chen Ping2, Bai Hong1
1.School of Medicine, Xi'an Peihua University,Xi'an 710125,Shaanxi,China
2.School of Pharmacy,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,Shaanxi,China
3.Engineering Center of Catalysis and Synthesis for Chiral Molecules,Department of Chemistry,Fudan University,Shanghai 200433,China
Abstract

The target compound 3,4-dihydro-2 H-pyrazino[2,1-b]quinazoline-1,6-dione(10) was successfully synthesized from anthranilamide(5) through four steps of intermolecular cyclization,alkylation,ammonolysis and intramolecular cyclization,the total yield of compound (10) was 46.5%.Intermediate (8),(9) and target compound (10) had not been reported,and their structures were confirmed by1H NMR and MS(ESI).The MTT assay was performed to evaluate anti-hepatoma activities of target compound.The results showed that compound (10) had significant inhibitory activity on SMMC-7721,which was better than the positive-drug sunitinib.Compound (10) can provide a lead structure for the further discovery of novel anti-hepatoma drugs,and also provide a reference for the massive synthesis and structural modification of these derivatives.

Keyword: fine chemical engineering; 3,4-dihydro-2 H-pyrazino[2,1-b]quinazoline-1,6-dione; fused n-heterocyclic rings; tricyclic; synthesis; anti-hepatoma activities

稠合氮杂环普遍存在于多种天然产物中, 在制药工业和材料科学中发挥着重要作用[1, 2]。特别是稠合的喹唑啉-4-酮是制备大量具有显著生物活性的生物碱类化合物的重要骨架[3, 4]。大约有150种天然的生物碱类化合物中含有稠合的喹唑啉-4-酮结构片段, 其中很多稠环结构具有抗肿瘤活性, 如色胺酮(Tryptanthrine)[5]、达尼喹酮(Batracyclin)[6]、鸭嘴花碱酮(Vasicinone)[7]、骆驼宁碱A(Luotonin A)[8]、吴茱萸次碱(Ruteacarpine)和吴茱萸碱(Evodiamine)[9]等。这些化合物具有类似的三环稠和喹唑啉杂环体系, 包括A、B和C环, 它们共有的主要结构骨架就是2, 3-稠合的(3H)-喹唑啉-4-酮, 结构如图1所示。

图1 具有稠合(3H)-喹唑啉-4-酮结构片段的代表性生物活性化合物Figure1 Representative bioactive compounds bearing fused quinazolin-4(3H)-ones as a structural fragment

虽然2, 3-稠合(3H)-喹唑啉-4-酮类化合物是许多天然产物结构改造的核心, 但由于合成难度较大, 对此类环体系的合成及活性研究较少。例如, 法国科学家Thierry Besson课题组[10]曾试图以2-氨基苯甲酸(1)为原料, 通过特殊试剂Appel盐(4, 5-二氯-1, 2, 3-二硫代鎓盐氯化物, 2)合成所设计的目标化合物3, 4-二氢-2H-吡嗪并[2, 1-b]喹唑啉-1, 6-二酮(10), 却只得到了亚氨基取代产物(4), 没能如期获得目标化合物, 合成路线如图2所示。

图2 Thierry Besson课题组假设的化合物(10)的合成路线Figure2 Hypothetic synthetic route of compound (10) by Thierry Besson's research group

本文经过反复探究, 设计了一种合成化合物(10)的新方法, 合成路线如图3所示。以邻氨基苯甲酰胺(5)为原料, 通过与草酸二乙酯经分子间环合得到中间体(6)[11], 中间体(6)经二溴乙烷烷基化反应得到中间体(8)[12], 中间体(8)经乙酯基的氨解反应得到中间体酰胺(9)[13], 中间体酰胺(9)经分子内环合得到目标产物(10)[14]。所有新化合物结构经1H NMR和MS(ESI)确证, 并采用MTT法对目标物进行初步的抗肝癌细胞活性研究。

图3 化合物(10)的合成路线Figure 3 Synthetic route of compound (10)

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

德国布鲁克公司AVANCF-300 MHz型核磁共振仪, DMSO-d6或CDCl3为溶剂, TMS为内标; GC/MS-QP2010气-质联用仪; XT-4型双目显微熔点仪; 酶标仪; 二氧化碳培养箱。

邻氨基苯甲酰胺、草酸二乙酯、二溴乙烷、氨甲醇溶液(7 N)、氢化钠、N, N-二甲基甲酰胺、石油醚、乙酸乙酯、碳酸钾、浓盐酸、四氢呋喃, 所用试剂和溶剂均为分析纯。

人肝癌细胞(SM-7721), 舒尼替尼阳性对照药。

1.2 化合物的合成

1.2.1 (6)的合成

将草酸二乙酯50 mL(0.366 mol)分批加入融化的邻氨基苯甲酰胺(5)6.8 g(0.05 mol)中, 回流反应48 h(TLC跟踪)。反应完全后, 减压蒸干过量的草酸二乙酯。所得白色固体用冷的乙醇洗涤, 过滤后滤饼在冷乙醚中搅拌0.5 h, 过滤得细小白色针状晶体(6)8.6 g, 收率78.9%, 熔点(190~191) ℃ [文献[11]为(190~192) ℃]。

1.2.2 (8)的合成

称取(6)2.18 g(10.0 mmol)和碳酸钾1.52 g(11.0 mmol), 溶解于干燥N, N-二甲基甲酰胺(50 mL)中, 室温搅拌下, 滴加1, 2-二溴乙烷2.06 g(11 mmol), 30 min滴加完毕, 室温反应4 h(TLC跟踪)。过滤除去碳酸钾, 并向滤液中加水200 mL, 用乙酸乙酯(3× 100 mL)萃取, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 旋蒸得到淡黄色油状物。经硅胶柱层析[洗脱剂:V(石油醚):V(乙酸乙酯)=5:1)]纯化得无色油状物, 加入少量的乙醇和适量的水, 超声条件下析出白色固体(8)2.50 g, 收率76.9%, 熔点(73~74) ℃。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ (ppm):8.32(d, J=7.9Hz, 1H), 7.81(d, J=3.5Hz, 2H), 7.59(dd, J=7.7, 4.3Hz, 1H), 4.64~4.45(m, 4H), 3.86(t, J=6.5Hz, 2H), 1.48(t, J=7.1Hz, 3H)。MS m/z calculated for C13H13BrN2O3 [M+H]+325.16, found 326.1。

1.2.3 (9)的合成

称取中间体(8)1.30 g(4.0 mmol)于一个50 mL的圆底烧瓶中, 分批加入氨的甲醇溶液8.0 mL (7 N), 室温搅拌过夜(TLC跟踪)。待反应完全后, 将反应液倾入冰水(40 mL)中搅拌10 min。用浓盐酸调节pH值为5~6, 得到大量白色沉淀, 抽滤并用水洗涤滤饼, 真空干燥得白色固体(9)1.04 g, 收率为88.14%, 熔点(171~173) ℃。1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ (ppm):8.32(d, J=8.0Hz, 1H), 7.81(t, J=7.6Hz, 1H), 7.72(d, J=8.1Hz, 1H), 7.59(t, J=7.5Hz, 1H), 7.52(s, 1H), 5.84(s, 1H), 4.97(t, J=6.5Hz, 2H), 3.90(t, J=6.5Hz, 2H)。MS(EI) m/z calculated for C11H10BrN3O2 [M+H]+. 296.12, found 216.1(MS-Br)。

1.2.4 (10)的合成

称取化合物(9)0.89 g(3.0 mmol)溶解于四氢呋喃(25 mL)中, 在(-5~0) ℃缓慢加入0.24 g(6.0 mmol)的60%NaH, 室温条件下搅拌1 h(TLC跟踪)。待反应完全后, 将混合物减压浓缩, 加入冰水淬灭反应, 过滤得到白色粗产物, 用冷水、石油醚依次洗涤滤饼得到目标化合物(10)0.56 g, 收率为86.8%, 熔点> 300 ℃。1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ (ppm):8.91(s, 1H), 8.18(d, J=7.7Hz, 1H), 7.89(t, J=7.2Hz, 1H), 7.82(d, J=8.0Hz, 1H), 7.63(t, J=7.4Hz, 1H), 4.22(m, 2H), 3.55(t, 2H)。MS m/z calculated for C11H9N3O2 [M+H]+ 215.21, found 215.1。

1.3 抗肝癌细胞活性测定

以舒尼替尼(sunitinib)为阳性对照药, 肝癌细胞系SMMC-7721作为受试细胞株, 采用MTT比色法初步测试目标化合物(10)体外抗肝癌细胞活性[15]。

肝癌细胞系SMMC-7721以含10%胎牛血清的DMEM培养基(Corning cat no. 10017236R), 37 ℃、5%CO2培养箱培养至对数生长期, 然后以0.02%EDTA-0.25%胰酶37 ℃消化2 min, 1 000 rpm离心5 min收集细胞, 制备1× 105/mL细胞悬液, 按100 μ L/孔将细胞接种于96孔细胞培养板, 37 ℃、5%CO2培养箱过夜培养细胞。将所测试的化合物(10)以二甲基亚砜配置为100 mmol· L-1贮存液, 分别按(0~50) mmol· L-1系列浓度梯度进行加药处理, 并设对照组, 均设3个复孔, 总体积200 μ L/孔, 继续37 ℃、5%CO2培养细胞24 h、48 h、72 h。每孔加入20 μ L/孔MTT(5 mg· mL-1), 继续培养(3~4) h, 移除培养液, 加150 μ L/孔二甲基亚砜, 室温下振荡15 min, 用酶标仪(λ =490 nm)测定待测液的吸光度值, 分别在24 h、48 h、72 h测定并记录产物对SMMC-7721细胞抑制活性。将抑制率与对应的药物浓度数据输入GraphPad Prism7.00软件中, 拟合抑制率变化曲线并计算半数抑制浓度(IC50)值。

2 结果与讨论
2.1 化合物的合成

目标化合物(10)三个环的构建经过四步完成。其中第一步按照文献报道的方法比较容易获得了中间体(6), 从而构建了A环和B环。该合成路线的新颖之处在于通过后续三个步骤构建C环。尽管每一步类似反应的具体方法和条件已在文献中报道, 但用于构建这种特殊骨架的整体合成路线尚未报道。这种新设计的合成路线是我们研究小组首次提出并成功验证, 并且已在其他相关稠环系统的合成中得到实践。

在探索这种合成路线的过程中, 也遇到许多困难。首先, 为了获得关键的中间体羧酰胺(9), 我们最初设计了另一种替代方法(见图3), 即将中间体(6)先经过氨甲醇氨解得到羧酰胺中间体(7), 然后尝试通过将(7)与1, 2-二溴乙烷进行常规烷基化来获得羧酰胺(9), 但无论用何种碱性催化剂(包括碳酸钾和氢化钠), 都无法得到所需烷基化产物。猜想羧酰胺(7)的惰性性质可能与喹唑啉上3-NH的正电子密度比羧酸酯(6)更高, 因为随后(6)通过烷基化试剂成功转化为中间体(8), 然后(8)经氨解又成功得到了中间体(9)。

合成路线的最后一步对我们研究小组来说是一项艰巨的任务, 就像Thierry Besson小组的相关类似研究工作一样。为了获得化合物(10), 最初尝试在室温下用碳酸钾对羧酰胺(9)进行分子内环化, 在连续反应15 h的TLC分析中未检测到任何新产物, 在油浴上升高反应温度也不能改善反应过程。经过反复试验, 考虑到催化碱的碱性可能太弱, 于是选择了碱性更强的氢化钠作为催化剂, 室温条件下反应1 h, 成功获得目标化合物(10), 总收率46.5%。受此结果鼓舞, 设想在相同的NaH条件下, 是否可以通过(7)和二溴乙烷之间的一步分子间缩合直接获得化合物(10), 但实验结果表明, 这种方法无法获得目标产物(图3)。

2.2 抗肝癌细胞活性

将化合物(10)通过配制成0 mmol· L-1、0.781 3 mmol· L-1、1.562 5 mmol· L-1、3.125 mmol· L-1、6.25 mmol· L-1、12.5 mmol· L-1、25 mmol· L-1、50 mmol· L-1共8个浓度, 分别处理细胞株24 h、48 h、72 h, 以舒尼替尼(sunitinib)为阳性对照药, 同法处理。采用MTT比色法测定其抗增殖作用, 结果如图4所示。 由图4可以看出, 肝癌细胞经8个不同浓度的化合物(10)作用24 h 后, 细胞生长均受到抑制, 但只有在浓度为50 mmol· L-1时, 其对肝癌细胞抑制率优于阳性对照组, 有极显著差异(P< 0.001)。化合物(10)与肝癌细胞作用48 h后, 浓度分别为25 mmol· L-1、50 mmol· L-1时, 其对肝癌细胞抑制率高于阳性对照组, 有极显著差异(P< 0.001)。化合物(10)与肝癌细胞作用72 h后, 在浓度为0.781 3 mmol· L-1时, 其对肝癌细胞抑制率高于阳性对照组, 有显著差异(P< 0.01); 在浓度为1.562 5 mmol· L-1时, 其对肝癌细胞抑制率高于阳性对照组, 存在极显著差异(P< 0.001); 在浓度为3.125 0 mmol· L-1时, 其对肝癌细胞抑制率高于阳性对照组, 有显著差异(P< 0.05); 而在其余的浓度条件下, 与对阳性对照组相比, 发现抑制率没有明显变化。

图4 化合物(10)与舒尼替尼对SMMC-7721细胞系的生物抑制活性对比图Figure 4 Biological inhibitory activity comparision of compound 10 with sunitinib against SMMC-7721 cell line

在GraphPad Prism7.00软件中, 拟合抑制率变化曲线并计算了化合物(10)、舒尼替尼对SMMC-7721细胞系分别在24 h、48 h和72 h的半数抑制浓度(IC50)值, 结果如表1所示。由表1可以看出, 化合物(10)在24 h、48 h和72 h的IC50值均小于阳性对照组, 初步表明化合物(10)是一种很有前途的新型抗肝癌药物先导化合物。

表1 化合物(10)、舒尼替尼对SMMC-7721细胞系分别在24 h、48 h和72 h的IC50值(mmol· L-1) Table 1 The IC50 values of the compound (10), sunitinib on SMMC-7721 cell line at 24 h, 48 h and 72 h respectively(mmol· L-1)
3 结 论

(1)以天然产物所共有的三环稠合喹唑啉结构模板, 开发了一种有效的构建2, 3-稠合的(3H)-喹唑啉-4-酮骨架的方法, 经过分子间环合、烷基化、氨解、分子内环合四步化学反应合成出一个结构新颖的3, 4-二氢-2H-吡嗪并[2, 1-b]喹唑啉-1, 6-二酮化合物(10), 并采用MTT法初步评价其体外抗肝癌活性。

(2)化合物(10)对肝癌细胞系SMMC-7721具有明显的抑制活性, 优于阳性对照药舒尼替尼, 为进一步发现新型抗肿瘤药物提供先导结构, 也为该类衍生物的大量合成和结构改造提供参考方法。

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